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线粒体复合体Ⅴ又称F1F0-ATP合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。

复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

• 试剂四：临用前每支加入1.3mL蒸馏水，充分溶解备用，用不完的试剂仍- 20℃保存。
  
• 试剂六、七、八：临用前加入对应体积蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周。
  
• 定磷试剂的配制：按H2O∶试剂七∶试剂八∶试剂九＝2∶1∶1∶1的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染。
  
  • 请根据需要，用多少配多少。
    
  • 配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。

• 准确称取0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一和10μL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
  
• 将匀浆600g，4℃离心5min。
  
• 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
  
• 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅴ（此步可选做）。
  
• 步骤4中的沉淀即为线粒体，加入800μL试剂二和8μL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅴ酶活性测定。

• 酶促反应
  
  • 按下表依次加入各成分：
    

    成分(μL)	对照管	测定管
    试剂四	25	25
    试剂五	100	100
    样本	－	125

  • 混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确水浴30min
    
  • 按下表依次加入各成分：
    

    成分(μL)	对照管	测定管
    试剂六	50	50
    样本	125	－

  • 混匀，4000g，25℃离心10min，取上清液。
• 定磷
  
  • 按下表依次加入各成分：
    

    成分(μL)	对照管	测定管
    上清液	170	170
    定磷试剂	830	830

  • 混匀，室温静置10min左右，在660nm处读取A_测定管和A_对照管，计算ΔA=A_测定管-A_对照管。

• 组织中复合体Ⅴ活性的计算：
  
  • 按样本蛋白浓度计算：
    单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
    复合体Ⅴ活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.004)÷1.274×V_反总×10⁶]÷(V_样×Cpr)÷T=62.8×(ΔA-0.004)÷Cpr
    此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
    
  • 按样本鲜重计算
    单位的定义：每g组织每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
    复合体Ⅴ活性(nmol/min/g鲜重)=[(ΔA-0.004)÷1.274×V_反总×10⁶]÷(W×V_样÷V_样总)÷T=50.7×(ΔA-0.004)÷W
    
  • 按细菌或细胞密度计算
    单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
    复合体Ⅴ活性(nmol/min/10⁴cell)=[(ΔA-0.004)÷1.274×V_反总×10⁶]÷(500×V_样÷V_样总)÷T=0.101×(ΔA-0.004)
  
  V_反总：反应体系总体积，3×10^-4 L；
  V_样：加入样本体积，0.125mL；
  V_样总：加入提取液体积，0.808mL；
  T：反应时间，30min；
  Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；
  W：样本质量，g；
  500：细胞或细菌总数，500万。